近日，国际顶级期刊Nature（《自然》）在线发表了题为“Digital colloid-enhanced Raman spectroscopy by single-molecule counting”的研究论文。该研究针对表面增强拉曼光谱领域内定量的挑战，系统阐述了基于数字胶体增强拉曼光谱（digital colloid-enhanced Raman spectroscopy, dCERS）的定量技术。基于单分子计数，dCERS成功实现了超低浓度目标分子的可靠定量检测，为表面增强拉曼光谱技术的普遍应用奠定了重要基础。
本文的第一作者为上海交通大学生物医学工程学院致远荣誉计划2020级博士研究生毕心缘，通讯作者为叶坚教授。作为资深作者，邵志峰教授在基本概念、数据解析以及文章的凝练、修改等方面做出了关键贡献。Daniel M. Czajkowsky教授也对数据的物理原理与文章修改做出了重要贡献。上海交通大学是论文的唯一完成单位和通讯单位。
研究背景
拉曼散射（Raman scattering）是Chandrasekhara Venkata Raman于1928年发现的一种指纹式的、具有分子结构特异性的非弹性散射光谱，并获得了1930年颁发的诺贝尔物理学奖。通过拉曼谱峰可以直接判断对应的分子结构，进而识别具体的分子的类型。该技术具有无需标记的优势，使其在物理、化学、生物、地质、医学、国防和公共安全等各个领域均具有重要的应用价值。
拉曼信号通常比较弱，因此信号增强就变得非常有必要。表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS）源于1974年英国南安普敦大学化学系Martin Fleischmann等人的一个重要实验。他们发现，在粗糙的银电极表面所附着的吡啶分子所产生的拉曼散射信号会被极大地增强，其物理原理在1977年分别由美国西北大学化学系David L. Jeanmaire和Richard P. Van Duyne以及英国肯特大学化学实验室M. Grant Albrecht和J. Alan Creighton从电磁场效应和电荷转移效应做出了解释。1997年SERS迎来了里程碑的事件——单分子SERS检测的实现。
自此，SERS技术被认为有希望使得拉曼光谱第二次获得诺贝尔奖。迄今为止，研究人员开发了各种不同的纳米增强基底，如纳米星、纳米海胆、纳米花、纳米森林等，通过采用不同的湿化学合成方案与芯片制造工艺，使得基底表面具有更为丰富的尖端、缝隙结构，形成更强的热点区域为其中的分子提供更高的增强能力，实现超低浓度的分子检测。
但是，随着SERS研究的不断深入，人们发现在低浓度检测时，拉曼信号强度存在极大的不可重复性。因此，具有单分子检测的灵敏度并不意味着超灵敏定量的实现。换言之，获得更高的增强因子只是实现SERS高灵敏定量检测的必要条件，而只有实现了具有可重复性的测量，SERS技术才具有实际应用与大规模推广的能力。很显然，这一困扰拉曼领域几十年的难题，难以在现有的技术框架中得到圆满解决。
图1. 数字胶体增强拉曼光谱技术概念图
dCERS成功实现
具有普适意义的
1fM水平定量灵敏度
上海交通大学生物医学工程学院叶坚教授和邵志峰教授团队发明了数字胶体增强拉曼光谱（dCERS），利用胶体纳米颗粒，可以实现较高效率的单分子检测。虽然单分子信号强度波动巨大，这与过去的研究结果相吻合，但与常见的单分子SERS技术不同的是，通过将光谱根据是否存在目标分子拉曼特征峰进行0/1数字化，亦即阴性光谱和阳性光谱（数字信号），随后对溶液中的阳性光谱进行计数。通过该单分子计数的方式可以实现对多种分子（如染料分子、代谢小分子、核酸、蛋白）的定量检测，定量检测限可以达到1fM以下（图2）。其中，dCERS技术所采用的胶体颗粒的合成步骤简单，易于放大生产，在应用中，可以方便地取出每个批次的少量颗粒来针对具体的目标分子预先建立标准曲线，从而可以可靠地用于后续未知浓度样本的定量。
图2. dCERS定量检测原理与不同种类分子的定量标准曲线
定量重复性精准可控
在实验中他们发现，这些通过阈值确定的单分子事件，其出现次数的分布完全符合泊松统计，因此通过阳性光谱的数量，可以直接简单地确定定量灵敏度与准确性，这与传统的基于模拟信号的定量方法完全不同。如图3所示，通过增加检测总光谱数，可以累积阳性光谱数量，从而有效提升定量的准确性，定量检测误差服从泊松噪声。因此在真实应用场景下，可以根据分子的检出概率和对于准确性、检测总时长等的需求，通过累积阳性光谱数来调控定量检测的准确性，由此dCERS定量检测具备精准可控的可重复性。
他们的发现还证明，针对不同的目标分子，尽管浓度与单分子计数的依赖关系具有不同的系数（需要分别进行标定），这些关系都符合吉布斯热力学的理论。事实上，这是第一次明确建立了单分子统计的物理基础，并可能适用于拉曼光谱之外的其它单分子计数技术。
图3. dCERS定量检测误差服从泊松分布
在环境保护、食品安全等领域的实用性
为了确立dCERS在实际测量中的潜力，该团队选取了百草枯和福美双作为展示实例（图4）。百草枯是一种高效、剧毒的除草剂，可以诱导帕金森氏病的发生，目前已有32个国家严格禁止其使用。福美双是一种含硫剧毒杀真菌剂，被欧盟归为二类致癌物。因此，超高灵敏度的、准确可靠的定量检测技术对于这些分子的检测非常重要，尤其是致癌物，原则上不存在安全剂量。
选取普通的湖水作为背景并混入微量的百草枯，该团队成功实现了低于欧盟最大残留量规定三个数量级的检测灵敏度。对于福美双，该团队选取了实验室培养的豆芽提取液，达到了优于质谱五个数量级的检测灵敏度。他们证明了，通过系列稀释的方法，检测中的背景干扰可以得到完美的抑制，从而实现准确的靶分子浓度的测量。而dCERS的超高灵敏度和可靠的统计分布是实现这些定量测量的关键基础。
图4. dCERS在微量分子检测中的应用
本工作展示了dCERS技术基于单分子计数实现了超低浓度目标分子在未知复杂背景中的可重复性定量，无需使用任何目标分子的特定标记。由于不同的目标分子大多具有独特的SERS光谱，dCERS可以实现多种不同分子的同时定量检测，因此具有很好的应用前景。另外，本工作使用的胶体纳米颗粒可以方便地进行大规模生产和制备，而检测方法相对简单，因此，dCERS有望进一步推动高灵敏检测技术的变革和进步。
今年刚好是发现SERS技术的50周年，可以预见，随着dCERS技术的进一步成熟，dCERS在生命科学、临床医学、环境保护、食品检测、国防与公共安全以及基础研究等领域都会得到广泛的应用。
该成果成员（从左往右）：邵志峰、叶坚、毕心缘、Daniel M. Czajkowsky
该工作得到了上海交通大学古宏晨教授、徐宏教授和沈峰教授的帮助，得到了国家自然科学基金委、国家重点研发计划、上海市科学技术委员会、上海市妇科肿瘤重点实验室、上海交通大学、王宽诚教育基金会的资助。
论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41586-024-07218-1
